乐山PCR实验室值得信赖「英瀚斯」执迷不悔

蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丁醇等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白质变性失活,因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。

染色质免l疫共沉淀技术(ChIP)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌l症、心血l管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一-种非常有效的工具。用1ml70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm，5min。

染色质免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内，当F与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNAl片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。腺相关病毒具有gan染温和,免yi原性小,长效稳定表达的特点,主要应用于动物体内注射。

RIP

技术概述

RIP是研究体内蛋白与RNA互作的重要技术。实验流程：细胞或组织RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。该技术先用甲醛等试剂交联细胞内的“蛋白-RNA”互作复合物，裂解细胞后，用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀，获得“靶蛋白-RNA”互作复合物，去交联分离其中的RNA;针对预测的靶蛋白结合RNA的序列设计引物，

做qPCR实验，验证预测的RNA是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的RNA做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的RNA。

技术流程

细胞交联-→细胞裂解-→免l疫共沉淀→去交联→RNA分离→建库→高通量测序(或qPCR)。

18.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。本方法采用两步法：推测试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5'端避免使用G。

◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在 68-70C 左右。

有用的荧光染料参数