转录组重测序
转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA的总和。转录组研究是基因功能及基因结构等研究的基础，通过新一代高通量测序，能够快速的获得某一物种特定组织或在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于临床诊断、基础研究和研发等领域。将含有靶基因mRNA同源互补序列的RNA（DoublestrandRNA，dsRNA）导入细胞后，能够特异地识别该mRNA，引起mRNA的降解，从而导致相应的功能缺失。
转录组Resequencing针对的是有参考基因组的物种。用新一代高通量测序技术对某物种的特定组织或细胞进行转录组测序，与参考基因组比较，可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。
分子与质粒载体构建
实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
5.长可以合成多长的引物？
答：引物越长，出现问题的概率就越大。有的公司合成过120base的引物，产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，的产量很低。PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以除去石蜡油。
6.需要合成多少OD数？
答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。从单个的生物体到qi官到组织到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构（如核酸序列），来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理（病理）状态的差异。片段越长, 全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
16.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。线粒体的组成可以从两个层面上反映物种及群体的遗传和进化，即核酸序列组成和基因组的结构特征，两者的特征具有不同的进化机制和进化速度，在进化生物学研究中可以很好的互补。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
17.如果测序发现突变，该如何处理？
答：遇到这种情况，首先和核酸合成厂家取得联系，生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下，建议重新挑取测序，可能会找到正确的。根据经验，40个碱基以下的引物，测1-2个就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，不过重合的引物和次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。乳糖发酵试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。